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NatMater三维3D水凝胶

来源:z理论 时间:2021/3/22
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神经祖细胞(NPC,neuralprogenitorcells)是未分化的多能或专能细胞,是人体组织中的原始细胞。它具有自我更新和分化为各种类型细胞的能力,神经祖细胞的干性维持对于治疗相关中枢神经系统退行性疾病,缺血损伤和肿瘤治疗等方面的研究具有非常重要的意义和应用价值。三维水凝胶(Hydrogels)是一种含有多种亲水基团,能在水中溶胀形成三维网络结构的高分子聚合物。还能构建类似于体内正常细胞的微环境,为干细胞的粘附、增殖、分化和迁移提供良好的细胞外基质。今天跟大家分享一篇发表在顶级期刊NATUREMATERIALS上的文章《Maintenanceofneuralprogenitorcellstemnessin3Dhydrogelsrequiresmatrixremodelling》。作者利用三维(3D)水凝胶来研究神经祖细胞的培养和干性维持,通过一系列实验得出结论:神经祖细胞的干性维持与水凝胶硬度(在0.5-50kPa范围内)无关,与水凝胶的降解性有关。研究证明,维持神经祖细胞在3D水凝胶中的干性需要基质重塑,通过三维水凝胶维持神经组细胞的干性为扩展临床上相关数量的功能活性神经祖细胞的产量提供了一种有吸引力的策略。

图1.免疫细胞化学证实,Nestin和Sox2的表达主要随水凝胶降解性而变化,而不随初始水凝胶硬度而变化。蓝色,DAPI(核);绿色,Nestin;红色,Sox2。标尺,25μm

在此项研究中,作者制备了一系列覆盖低、中和高硬度范围的水凝胶,在每个硬度范围内具有高、中和低降解性凝胶。通过测量NPC干细胞标记Nestin和Sox2的mRNA表达,评估这些凝胶中NPC干性的变化。如图1所示,随着水凝胶降解性的增加,Nestin和Sox2的表达显著增加,而表达与初始水凝胶硬度无关。结果表明,NPC在这些水凝胶中的干性维持与降解性有关,与水凝胶的硬度(在0.5-50kPa范围内)无关。

图2a.基于水凝胶降解性,细胞骨架张力在指导NPC干性中的可能作用,图b.在高降解水凝胶中存在抑制剂的情况下,培养7d后,Nestin和Sox2的表达情况

为了验证降解产生的细胞骨架张力是否是NPC在水凝胶中维持干性的原因(图2a)。作者选取了脑组织硬度范围在0.5-1.5kPa的水凝胶,用小分子抑制剂(如肌球蛋白II、Cdc42、RhoA/B/C、PAK1和ROCK)处理高降解凝胶中的NPCs,以抑制细胞骨架张力。如图b所示,抑制细胞骨架张力对Nestin和Sox2的表达没有影响,这表明高降解性凝胶中的干性维持不是由于张力的产生。

图2c.ELP细胞粘附的氨基酸序列结合整合素的RGD序列和不结合整合素的RDG序列,图d.培养7天后,mRNA在具有不同降解性的水凝胶中NPC标记Nestin和Sox2的表达。

为了进一步验证水凝胶降解导致的粘附配体聚集是否是NPC在水凝胶中维持干性的原因。将细胞封装在含有不结合整合素的蛋白、干扰精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸(RDG)序列的配体聚集的ELPs中(图2c)。在存在或不存在RGD配体的情况下,Nestin和Sox2的表达趋势相似(图2d)。综上所述,3D水凝胶中NPC干性的维持与粘附配体浓度和细胞骨架张力的产生无关。

图2e.描述了敲除ADAM9会导致水凝胶降解减少,导致NPC干性的降低,图f.敲除ADAM9基因,在3D水凝胶中培养3天后,Nestin和Sox2的表达降低

金属蛋白酶9(ADAM9)是参与NPC介导的ELP水凝胶重塑的主要蛋白酶之一。为了验证ADAM9介导的基质重塑是否是NPC在水凝胶中维持干性的原因。作者敲除了封装的NPC中ADAM9的表达,发现水凝胶的降解显著减少,Nestin和Sox2表达也相应地减少(图2f)。表明ADAM9介导的基质重塑是维持3DELP水凝胶中NPC干性的原因。

图3a.低降解凝胶在培养7天后表现出很少的基质重塑,图b.高降解ELP凝胶随着时间的推移表现出明显的基质重塑,导致显著的细胞扩散和细胞间接触。

为了研究基质重塑调节NPC干性的机制,将绿色荧光蛋白(GFP)阳性NPC封装在Cy5标记的ELP水凝胶中,以使基质材料重塑。在低降解性凝胶中,NPC基本上不会重塑水凝胶,而是保持圆形和分离状态(图3a)。相反,高降解性凝胶中的NPC会重塑基质,从而在包封后3天允许大量细胞扩散(图3b)。

图3f.ADAM9介导的基质重塑通过调节钙粘蛋白介导的细胞间接触来调节NPC干细胞的机制。

为了验证基质重塑是通过促进钙粘蛋白介导的细胞间接触而增强NPC干性的假设,用钙粘蛋白结合抑制剂(环状HAV肽)处理高降解性凝胶中的NPC。发现干性的维持需要钙粘蛋白介导的接触。在降解性较差的凝胶中,细胞密度的增加导致Nestin和Sox2表达的适度增加。这些结果表明,基质重塑促进了钙粘蛋白介导的细胞间接触,进而促进了干性的维持(图3f)。

图4e.物理交联海藻酸钠水凝胶与共价交联凝胶的重塑,图f.物理交联的海藻酸钠水凝胶促进基质重塑、细胞扩散和维持Nestin和Sox2的表达,共价交联阻碍了基质重塑和细胞扩散,导致干性丧失。标尺,25μm

为了进一步证明上述结果对其他生物材料系统的通用性,使用其他模式的基质重塑来维持NPC的干性。如图4e和f所示,物理交联海藻酸盐凝胶经过物理重塑实现3D细胞扩散,细胞间接触,进而促进了干性的维持,这与ELP材料的结果一致。通过在海藻酸盐凝胶中添加共价交联键来抑制物理重塑,可抑制细胞扩散并降低NPC干性。综上所述,这些结果表明,通过化学蛋白水解或物理网络重塑,基质重塑可促进3D水凝胶中NPC干性的维持。这个工作的亮点在于利用三维(3D)水凝胶维持神经组细胞的自我更新和分化能力,详细地研究了NPC干性的维持与水凝胶的基质重塑有关。利用水凝胶基质重塑维持NPC培养和干性是扩大治疗相关中枢神经系统退行性疾病,缺血损伤和肿瘤治疗等的有效的策略。本文中,在三维(3D)水凝胶中培养和观察神经组细胞的行为和发展,体现了水凝胶具有良好的生物相容性、表面活性和可降解性。其三维网状结构类似体内正常细胞的微环境,为干细胞的粘附、增殖、分化和迁移提供良好的细胞外基质,在组织工程及药物的控制释放等领域具有广阔的应用前景。深入了解水凝胶的理化特性,对于培养干细胞和组织再生方面研究具有巨大的潜在应用价值和重大理论研究意义。

参考文献

1.MadlCM,LesavageBL,DewiRE,etal.Maintenanceofneuralprogenitorcellstemnessin3Dhydrogelsrequiresmatrixremodelling[J].NatureMaterials,,16(12):-.

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